AAV 基因治療 (AAV Gene Therapy)完整指南：從病毒學、基因遞送到臨床成功與安全挑戰

Executive Summary

如果你只想花三分鐘閱讀這篇文章，我希望你先記住六件事。

1. Gene Therapy 的真正挑戰，不只是找到治療基因，而是如何把基因安全、有效地送進正確的細胞。

2. AAV（Adeno-associated virus）是目前最成熟的 in vivo gene delivery platform 之一。研究人員移除病毒本身大部分的基因，只保留遞送所需的結構，再放入治療用的 DNA。

3. AAV 的優勢是能在許多不活躍分裂的細胞中維持較長時間的基因表現，而且 recombinant AAV 主要以 episomal DNA 形式存在。不過，「主要不整合」不代表完全不可能發生低頻率的基因體整合。

4. AAV 也有明確限制。它的載量通常只有約 4.7 kb，患者可能已經具有中和抗體，治療後也通常難以再次使用相同或相近的 capsid。

5. 高劑量、全身性 AAV 治療的風險，不能和低劑量、局部給藥的 AAV 混為一談。肝毒性、補體活化、血小板下降、免疫性肌炎與部分神經毒性，都是臨床開發必須管理的問題。

6. 下一代 Gene Therapy 不會只有 AAV。AAV、LNP、Lentivirus、Virus-like Particle（VLP）與其他 delivery platforms，將依疾病、目標器官與治療機制形成互補關係。

前言：為什麼我想重新介紹 AAV Gene Therapy？

近幾年，只要談到 Gene Therapy，幾乎一定會提到 AAV。

從治療遺傳性視網膜疾病的 Luxturna、治療脊髓性肌肉萎縮症的 Zolgensma，到血友病基因治療 Hemgenix、Roctavian，以及備受關注的 Duchenne muscular dystrophy 治療 Elevidys，AAV 已經從實驗室中的研究工具，逐步成為真正能改變疾病自然病程的治療平台。FDA 目前列出的核准細胞與基因治療產品中，也包含多項以 AAV 為基礎的療法。 (U.S. Food and Drug Administration)

但每次和學生、朋友，甚至投資人聊天時，我發現大家對 AAV 經常有兩種完全不同的疑問。

沒有生物背景的人通常會問：

病毒不是會讓人生病嗎？為什麼現在反而要把病毒打進人體？

已經從事 Gene Therapy 或藥物研發的人，則可能更在意：

AAV 的 tissue tropism 到底是由哪些因素決定？

為什麼相同 capsid 換了一個 expression cassette，毒性與藥效可能就完全不同？

為什麼實驗室裡看起來很簡單的 AAV，到了 GMP manufacturing 就變得如此昂貴而複雜？

因此，這篇文章會分成兩個部分。

前半段從 DNA、蛋白質、病毒與 gene delivery 開始，即使沒有科學背景，也可以逐步理解 AAV 為什麼能用來治療疾病。

後半段則會進一步討論 AAV genome、capsid biology、tissue tropism、expression cassette、manufacturing、quality control、臨床安全性與下一代 vector engineering。

我希望這不只是一篇 AAV 名詞解釋，而是一篇能讓不同背景讀者，從同一個入口進入 Gene Therapy 世界的完整指南。

閱讀指南

Part I｜Fundamental Science

適合第一次接觸 Gene Therapy 的讀者。

你將了解：

• DNA、RNA 與 protein 的關係

• 遺傳疾病為什麼會發生

• Gene Therapy 到底在治療什麼

• 為什麼 delivery 才是最大的挑戰

• 病毒如何被改造成治療工具

• AAV 和一般致病病毒有什麼不同

Part II｜Advanced AAV Biology and Development

適合生命科學研究生、生技研發人員、Gene Therapy 與 AAV 科學家。

內容包括：

• AAV genome 與 recombinant vector design

• Capsid structure、serotype 與 tissue tropism

• Promoter、transgene 與 regulatory element

• AAV payload limitation

• Manufacturing、purification 與 quality control

• 臨床產品與安全性

• Elevidys 案例

• Next-generation AAV engineering

• AAV、LNP 與其他 delivery platforms 的定位

Part I｜Fundamental Science：給非科學背景讀者的基因治療入門

人體其實是一座蛋白質工廠

很多人第一次聽到 Gene Therapy，直覺會認為這是在「改造人類基因」。

但大多數已上市的 AAV gene replacement therapy，主要目的並不是重新設計一個人的基因體，而是提供一份可以正常工作的基因，讓特定細胞重新製造患者缺少的蛋白質。

人體的細胞每天都在製造大量蛋白質。

蛋白質不只存在於健身補充品中。人體內大部分真正執行功能的分子，本質上都是蛋白質。

例如：

• Insulin 協助調節血糖。

• Factor VIII 與 Factor IX 參與凝血反應。

• Dystrophin 幫助肌肉細胞承受收縮時產生的機械壓力。

• SMN protein 對運動神經元的存活與正常功能非常重要。

• RPE65 參與視網膜中的 visual cycle。

如果一個基因因突變而無法產生足夠且具有功能的蛋白質，細胞的運作就可能逐漸出現問題。

這也是許多單基因疾病的起點。

DNA 就像人體的說明書，但說明書本身不負責工作

我常用食譜來解釋 DNA。

假設你有一本蛋糕食譜，正確內容應該是：

麵粉 200 克。

但因為印刷錯誤，變成：

麵粉 20 克。

無論廚師多麼努力，只要一直依照錯誤的食譜製作，最後做出來的蛋糕就很難正常。

人體也是如此。

DNA 保存的是製造分子的指令；RNA 將其中一部分指令傳遞出去；protein 則是根據指令製造出來、真正執行功能的產物。

這個資訊流動經常被簡化為：

DNA → RNA → Protein

這就是分子生物學中常說的 Central Dogma。

Gene replacement therapy 的概念，是把一份可以正常表現的 DNA 送進細胞，讓細胞開始製造患者所缺少的蛋白質。

Gene Therapy、mRNA Therapy 和 Gene Editing 有什麼不同？

這三個名詞經常一起出現，但它們不是同一件事。

Gene replacement therapy

提供一份功能正常的基因，讓細胞製造治療性蛋白質。

AAV gene therapy 多數屬於這種類型。

它通常不需要把患者原本的突變基因移除，而是額外提供一份可以工作的 gene expression cassette。

mRNA therapy

直接把 mRNA 送進細胞質，讓細胞在一段時間內製造蛋白質。

因為 mRNA 通常會逐漸降解，所以表達時間相對短暫，但也因此比較容易控制，並具有重複給藥的可能性。

Gene editing

利用 CRISPR-Cas、base editor 或 prime editor 等工具，直接修改細胞中的 DNA。

它可以切除、修正或關閉特定基因，但同時需要非常精準地控制 delivery、editing efficiency 與 off-target risk。

簡單來說：

• Gene replacement 是「補上一份正確的說明書」。

• mRNA therapy 是「直接提供一份暫時使用的工作指令」。

• Gene editing 是「修改原本那本說明書」。

真實疾病案例：Gene Therapy 到底要補上什麼？

Spinal Muscular Atrophy

Spinal muscular atrophy，簡稱 SMA，是一種嚴重的遺傳性神經肌肉疾病。

患者通常缺乏可以正常工作的 SMN1 gene，造成 survival motor neuron protein 不足，運動神經元逐漸失去功能。

Zolgensma 使用 AAV9-based vector 遞送一份功能正常的 SMN1 transgene，用來治療兩歲以下、帶有雙等位 SMN1 突變的 SMA 兒童。 (U.S. Food and Drug Administration)

這個例子很重要，因為它顯示 Gene Therapy 的目標並不是讓已死亡的神經元重新復活，而是盡早提供缺少的蛋白質，降低疾病持續進展造成的不可逆傷害。

Hemophilia B

Hemophilia B 患者缺少或無法正常製造 Factor IX。

傳統治療通常需要長期補充凝血因子。AAV gene therapy 的思路，則是把 Factor IX gene 送進肝細胞，讓患者自己的肝臟成為凝血因子的「生產工廠」。

Hemgenix 是一項用於特定成人 Hemophilia B 患者的 AAV5-based gene therapy。它的目標是降低出血頻率與對 Factor IX replacement therapy 的需求。 (U.S. Food and Drug Administration)

遺傳性視網膜疾病

Luxturna 用於具有 confirmed biallelic RPE65 mutation-associated retinal dystrophy，而且仍保有可存活視網膜細胞的患者。治療並不是從全身靜脈注射，而是透過局部眼科手術將 vector 投遞至視網膜相關區域。 (U.S. Food and Drug Administration)

這也說明一件很重要的事：

Gene Therapy 的效果與風險，不只由 vector 決定，也和給藥位置、劑量、目標細胞與疾病進程有關。

Gene Therapy 最困難的問題，其實是 Delivery

當科學家找到造成疾病的基因後，治療問題並沒有因此自動解決。

DNA 是一個大型、帶負電的分子。

細胞外部有細胞膜，細胞內部還有 endosome、cytosol、nuclear membrane 等多層障礙。即使 DNA 成功進入細胞，也不代表它能順利到達細胞核、維持穩定，並以正確的時間與劑量表現。

一個成功的 gene delivery system，至少必須完成幾件事：

1. 在體內維持足夠的穩定性。

2. 到達需要治療的器官。

3. 進入正確的細胞。

4. 避免在 endosome 中被降解。

5. 把 genetic cargo 運送到正確的細胞區域。

6. 產生足夠的蛋白質表現。

7. 不造成不可接受的免疫或毒性反應。

因此，找到疾病基因只是第一步。

能不能把治療性 cargo 送到對的地方，才是 Gene Therapy 能否成功的關鍵。

Gene Delivery Platform 有哪些？

目前常見的方法大致可以分成三類。

Physical delivery

例如 electroporation、microinjection 或其他物理方式。

這些技術可以短暫改變細胞膜通透性，讓 DNA、RNA 或 protein 進入細胞。

它們在 ex vivo cell engineering 中非常實用，例如先把細胞取出體外、完成基因操作後，再輸回患者體內。

但要在人體內直接對大量、分散於不同器官的細胞進行 electroporation，通常並不實際。

Non-viral delivery

最具代表性的例子是 Lipid Nanoparticle，也就是 LNP。

LNP 已證明可以有效遞送 mRNA 與 siRNA，目前也被廣泛研究用於 CRISPR components 和其他 nucleic acid cargo。

它的優勢包括：

• 不需要使用病毒蛋白殼

• 製程相對模組化

• 可以遞送較大或不同形式的核酸

• 部分應用具有重複給藥的可能性

但目前多數系統仍高度偏向肝臟，如何精準投遞到其他器官與特定細胞，是下一代 LNP 的重要研究方向。

Viral delivery

病毒經過長期演化，本來就非常擅長找到細胞、進入細胞並傳遞 genetic material。

Gene Therapy 所做的事情，是把病毒原本用來複製與致病的基因移除，再放入治療用的 genetic cargo。

病毒因此從病原體，轉變成經過工程設計的 delivery vehicle。

病毒為什麼是天然的基因遞送機器？

假設人體是一座城市，細胞是一棟棟建築物。

病毒就像一個熟悉城市道路的快遞系統。

它必須完成：

• 辨認地址：找到細胞表面的 receptor 或 attachment factor。

• 進入建築物：透過 membrane fusion 或 endocytosis 進入細胞。

• 離開收發室：逃離 endosome 或完成 intracellular trafficking。

• 抵達辦公室：進入細胞核或需要作用的細胞區域。

• 打開包裹：完成 uncoating，釋放 genetic material。

• 執行指令：利用宿主細胞的分子機器表現病毒基因。

病毒會讓人生病，通常不是因為「delivery」本身，而是因為它送進去的是病毒自己的基因，並利用細胞大量複製、破壞組織或引發強烈免疫反應。

Gene Therapy 的基本工程概念，就是：

保留病毒最有效率的遞送能力，移除不需要的複製與致病功能，再換上治療性 cargo。

病毒的基本結構

多數病毒具有兩項核心結構。

Viral genome

可能是 DNA 或 RNA，也可能是 single-stranded 或 double-stranded。

它保存病毒複製與組裝所需的資訊。

Capsid

Capsid 是由蛋白質組成的外殼，用來保護 viral genome。

Capsid 不只是包裝。

它也會影響：

• 細胞附著

• Receptor interaction

• Tissue tropism

• Intracellular trafficking

• Antibody recognition

• Genome packaging

• Capsid stability

部分病毒外面還有 lipid envelope，例如 influenza virus 與 coronavirus。

AAV 則是沒有 envelope 的小型 single-stranded DNA virus。

為什麼選擇 AAV？

AAV 的全名是 Adeno-associated virus。

它最初是在 adenovirus 樣本中被發現，也因為 wild-type AAV 通常需要 helper virus 所提供的功能，才能有效完成 productive replication，因此被歸類為 dependoparvovirus。

AAV 之所以成為重要的 Gene Therapy platform，通常有幾個原因：

• 目前沒有明確證據顯示自然感染的 AAV 會造成特定人類疾病。

• 可透過 capsid 與給藥方式調整組織分布。

• 可在許多不活躍分裂的細胞中建立相對持久的 transgene expression。

• Recombinant AAV 移除了大部分原生病毒基因，不具備自行複製所需的完整功能。

• 已經累積多項臨床試驗與核准產品經驗。

但這裡必須特別澄清：

AAV 經常被稱為「non-integrating vector」，比較精確的說法應該是，recombinant AAV 在多數情況下主要以 episomal forms 存在，基因體整合的頻率相對低，但並不是絕對不可能整合。AAV integration 與長期安全性仍然是持續研究與追蹤的議題。 (PubMed)

如果你是第一次接觸 Gene Therapy，閱讀到這裡，已經足以理解大部分 AAV 新聞的基本概念。

接下來，我們會進一步進入 AAV vector design、capsid biology、manufacturing、CMC 與 clinical safety。

Part II｜Advanced AAV Biology：給研究人員與產業人士的進階介紹

Wild-type AAV genome：一個很小、但高度濃縮的病毒基因體

Wild-type AAV genome 大約為 4.7 kb，是一個 single-stranded DNA genome。

核心結構包括：

• 兩端的 inverted terminal repeats，簡稱 ITRs

• rep gene

• cap gene

ITR 約為 145 bases，可以形成特殊的 hairpin structures，參與 genome replication、rescue 與 packaging。

Rep 區域產生多種 replication proteins，例如 Rep78、Rep68、Rep52 與 Rep40，參與 genome replication 與 packaging。

Cap 區域則產生 VP1、VP2、VP3 等 structural proteins，形成 AAV capsid。 (Addgene)

AAV capsid：不只是一個包裝外殼

AAV capsid 是一個具有 icosahedral symmetry 的 protein shell。

每個 capsid 由總計約 60 個 VP subunits 組成，主要包含 VP1、VP2 與 VP3。傳統上經常以接近 1:1:10 的比例描述，但實際組成可能受到 serotype、production system 與 assembly process 影響，並不一定是完全固定的比例。 (Nature)

VP3 形成 capsid shell 的主要結構。

VP1 與 VP2 的 N-terminal extensions 則和 intracellular trafficking、endosomal escape、nuclear entry 等過程有關。

Capsid surface 的特定 amino acid residues，也會影響：

• Receptor binding

• Cell attachment

• Antibody recognition

• Tissue distribution

• Intracellular trafficking

• Uncoating

• Manufacturing yield

• Capsid stability

因此，capsid engineering 並不是只在調整「它去哪一個器官」。

一個新的 capsid 必須同時平衡許多性質：

• 能不能生產？

• 能不能正確組裝？

• 能不能有效裝入 genome？

• 在血液中是否穩定？

• 是否容易被抗體辨認？

• 能否進入目標細胞？

• 能否成功完成 intracellular trafficking？

• 是否會在非目標器官累積？

• 是否產生新的免疫或毒性風險？

這也是為什麼在小鼠中表現很好的 engineered capsid，不一定能直接轉換到 nonhuman primate，更不代表一定能在人類成功。

Recombinant AAV 是如何被重新設計的？

在 therapeutic recombinant AAV 中，wild-type AAV 原本的 rep 與 cap coding sequences 通常會從 vector genome 中移除。

取而代之的是一個 expression cassette，通常包括：

• Promoter

• Enhancer

• Therapeutic transgene

• Intron，視設計需要加入

• Polyadenylation signal

• 其他 regulatory elements

這個 expression cassette 仍由兩端 ITR flanking。

生產時，rep、cap 與 helper functions 會以 trans 的方式由其他 plasmids 或 production components 提供。也就是說，這些生產所需基因協助細胞組裝 vector，但不應成為最終 therapeutic vector genome 的主要內容。

常見的 transient triple transfection system 通常包括：

1. Vector plasmid

   
   

   含 ITR-flanked therapeutic expression cassette。

2. Rep/Cap plasmid

   
   

   提供 AAV replication proteins 與指定 capsid proteins。

3. Helper plasmid

   
   

   提供原本由 adenovirus 等 helper virus 供應的功能。

這種設計讓 recombinant AAV 能攜帶治療基因，但失去自行複製與形成下一代病毒所需的完整 genetic machinery。

從細胞外到細胞核：AAV transduction 並不是只有「進入細胞」

AAV transduction 是一連串步驟的總和。

大致包括：

1. 與細胞表面 attachment factors 或 receptors 互動。

2. 經由 endocytosis 進入細胞。

3. 在 endosomal system 中進行 trafficking。

4. 避免被送往 lysosomal degradation。

5. Capsid 產生構形變化。

6. 完成 endosomal escape。

7. 移動至細胞核附近。

8. 進入細胞核。

9. Uncoating 並釋放 vector genome。

10. Single-stranded genome 經 second-strand synthesis，或與 complementary strand annealing。

11. 形成較穩定的 episomal DNA structures。

12. 啟動 transgene transcription 與 protein expression。

每一個步驟都可能成為效率瓶頸。

因此，當一個 capsid 在某個細胞中表現不好，不一定是因為它完全無法進入細胞，也可能是：

• 無法有效逃離 endosome

• 核輸送效率不足

• Uncoating 太慢

• Genome conversion 不佳

• Promoter 在該細胞中不活躍

• Transgene mRNA 或 protein 不穩定

這也是評估 AAV vector 時，不能只看總組織 vector genome copy number 的原因。

有 DNA 到達組織，不代表一定產生具有治療意義的 protein expression。

Serotype 與 tissue tropism：不是一張固定不變的器官地圖

不同 AAV capsid 具有不同的 biodistribution 與 cell transduction profile。

常見例子包括：

AAV capsid／serotype	常見研究或應用方向	代表性案例
AAV2	Retina、CNS local delivery	Luxturna、Upstaza
AAV5	Liver-directed delivery	Hemgenix
AAV8-related capsids	Liver、部分 muscle applications	多項 liver-directed programs
AAV9	CNS、muscle、systemic delivery	Zolgensma
AAVrh74	Skeletal muscle-directed systemic delivery	Elevidys

但這張表只能當作簡化的起點。

Tissue tropism 並不是由 capsid 單獨決定。

實際表現還會受到以下因素影響：

• Species difference

• Route of administration

• Dose

• Age

• Disease state

• Vascular permeability

• Pre-existing immunity

• Receptor abundance

• Promoter specificity

• Vector genome design

• Manufacturing attributes

• Assay used to define transduction

例如，某些 AAV9-based vectors 在動物模型中能表現出廣泛 CNS distribution，但跨越 blood-brain barrier 的程度具有物種、年齡與劑量依賴性，不能簡化為「AAV9 一定可以有效穿過所有人的 BBB」。

Promoter engineering：到達器官，並不等於在正確細胞中表現

Capsid 決定 vector 能到達哪些組織與細胞，但 promoter 與其他 regulatory elements 則進一步決定 transgene 在哪裡表現、表現多少，以及維持多久。

常見的 promoter 類型包括：

• CMV

• CAG

• EF1α

• Liver-specific promoters

• Muscle-specific promoters

• Neuron-specific promoters

• Cell type-specific synthetic promoters

選擇強度最高的 promoter，並不一定是最好的設計。

過高的 transgene expression 可能造成：

• Protein misfolding

• ER stress

• Cellular toxicity

• Unwanted expression in off-target cells

• Increased antigen presentation

• Stronger immune recognition

相反地，過弱的 promoter 又可能無法達到 therapeutic threshold。

因此，expression cassette optimization 的核心不是追求最大表現，而是建立合適的 therapeutic window。

Payload limitation：為什麼 AAV 只能裝大約 4.7 kb？

AAV 的天然 genome 大約只有 4.7 kb，capsid 的空間也相當有限。

Therapeutic payload 不只包括 coding sequence，還要容納：

• ITRs

• Promoter

• Regulatory elements

• Transgene coding sequence

• Polyadenylation signal

當 vector genome 超出合理的 packaging range，可能出現：

• Packaging efficiency 降低

• Genome truncation

• Heterogeneous packaged genomes

• Reduced full-length genome proportion

• Lower potency

• Product characterization 更複雜

近期的 genome packaging 分析也顯示，當 vector genome 接近約 4.9–5.0 kb 時，full-length packaged genome 的比例可能快速下降。 (ScienceDirect)

為什麼 Elevidys 使用 micro-dystrophin？

Duchenne muscular dystrophy 是由 DMD gene mutation 造成。

Full-length dystrophin coding sequence 太大，遠超出單一 AAV vector 的正常容量。

因此，研究人員不是把完整 dystrophin gene 塞進 AAV，而是設計縮短版的 micro-dystrophin。

Micro-dystrophin 會保留部分被認為對肌肉細胞結構與功能重要的 domains，同時移除部分非必要區域，讓 coding sequence 能放入 AAV expression cassette。

這是一種工程上的折衷：

• 它不是 full-length dystrophin。

• 它也不代表能完全恢復正常肌肉。

• 目標是產生足以改變疾病進展的 functional protein。

因此，評估這類療法時，不能只問「有沒有表現 micro-dystrophin」，還必須進一步問：

• 表現在哪些肌肉？

• 有多少肌纖維表現？

• Protein localization 是否正確？

• 表現量是否足夠？

• 能否轉化為持久的 functional benefit？

• 隨著患者成長與疾病進展，效果能維持多久？

Self-complementary AAV：用載量交換表達速度

傳統 single-stranded AAV 進入細胞後，需要完成 second-strand synthesis 或 complementary strand annealing，才能形成適合 transcription 的 double-stranded template。

Self-complementary AAV，簡稱 scAAV，會包裝具有自我互補特性的 genome，使其更快形成 double-stranded DNA，通常可以加快 transgene expression。

但代價是可用 payload capacity 進一步減少，大約只剩傳統 AAV 的一半。

因此，scAAV 適合較小的 transgene，並不適合所有疾病。

這再次顯示，AAV engineering 本質上是一連串 trade-off。

大型基因的解決方案：Dual AAV 與其他分段策略

對於超過單一 AAV 容量的基因，可以考慮 dual-vector strategy。

將 therapeutic gene 分成兩部分，分別裝入兩個 AAV vectors，再期待它們進入同一個細胞後，透過：

• Homologous recombination

• Trans-splicing

• Hybrid approaches

• Protein trans-splicing

重新建立完整或接近完整的產物。

但 dual AAV 也會帶來新的問題：

• 同一細胞必須同時收到兩個 vectors。

• Reconstitution efficiency 可能不足。

• 產品劑量與製造複雜度提高。

• 可能產生不完整或異常中間產物。

• Analytical characterization 更困難。

因此，dual AAV 並不是簡單地把兩支 vector 混在一起，而是一個完整的新產品設計問題。

AAV Manufacturing：一支基因治療藥物是怎麼製造出來的？

很多人看到 AAV 的結構很小，會直覺認為它應該容易製造。

實際上，AAV 是目前相當複雜的 biologics manufacturing products 之一。

最廣泛使用的生產方法之一，是在 HEK293 cells 中進行 transient triple-plasmid transfection。除此之外，也有 producer cell line、baculovirus/Sf9 與其他 production systems。

Triple transfection 具有高度彈性，capsid 與 transgene cassette 可以相對快速更換，適合不同產品開發。

但它也面臨：

• 大量 GMP-grade plasmid 需求

• Transfection consistency

• Scale-up complexity

• Batch-to-batch variability

• Cell density 與 transfection timing 的控制

• Plasmid ratio 與 reagent mixing 的影響

• Yield 與 product quality 不穩定

Triple transfection 仍是廣泛使用的 rAAV production method，但低 yield、full-to-empty ratio 與 process reproducibility 一直是重要挑戰。 (ScienceDirect)

AAV downstream process：從細胞培養液變成藥品

AAV production 完成後，並不是直接把細胞培養液裝進 vial。

一般流程可能包括：

1. Cell harvest 或 culture supernatant collection

2. Cell lysis，視 vector 與 process 而定

3. Nuclease treatment

4. Clarification

5. Concentration and buffer exchange

6. Affinity chromatography

7. Ion-exchange chromatography

8. Empty/full capsid enrichment

9. Additional polishing

10. Sterile filtration

11. Formulation

12. Fill and finish

每一個步驟都可能造成 vector loss、aggregation 或 potency change。

而不同 capsid 的表面性質不同，同一套 purification process 不一定可以直接套用到另一個 serotype 或 engineered capsid。

這也是 platform manufacturing 很有吸引力、但實務上又非常困難的原因。

Empty、partial 與 full capsid：為什麼是重要的 CMC 問題？

在生產過程中，不是每一個 capsid 都會成功裝入完整 therapeutic genome。

最終產品可能包含：

• Full capsids

• Empty capsids

• Partially filled capsids

• Capsids containing truncated genomes

• Capsids containing unintended DNA fragments

• Aggregates

• Degraded particles

Full capsid 通常指包含預期 therapeutic genome 的 vector particle。

Empty capsid 則具有 capsid shell，但沒有裝入完整的 vector genome。

Partial capsid 可能含有不完整或異常的 DNA。

這些 capsid populations 的實際影響會因產品而異，但 empty 與 intermediate capsids 通常被視為需要控制的 product-related impurities，因為它們可能增加不必要的 capsid antigen burden，也可能影響產品的一致性與 potency interpretation。 (Nature)

不過，這並不代表所有產品都必須達到完全相同的 full capsid percentage。

真正的 CMC 問題是：

• 製程能否穩定控制？

• Analytical method 是否準確？

• Specification 是否有臨床與製程依據？

• 不同 capsid populations 是否會改變 safety 或 efficacy？

• Batch comparability 是否成立？

AAV Quality Control：不是測到 vector genome titer 就結束

AAV 的品質分析通常需要涵蓋 identity、purity、quantity、potency 與 safety。

常見項目包括：

Vector genome titer

常以 qPCR 或 ddPCR 測量 vector genome concentration。

但 qPCR/ddPCR 測到的是 DNA target，不一定代表每一個 genome 都完整，也不等於每一個 particle 都有生物活性。

Capsid titer

可透過 ELISA、mass-based 或其他 analytical methods 評估 capsid concentration。

Full-to-empty ratio

可能使用：

• Analytical ultracentrifugation

• Charge-detection mass spectrometry

• Mass photometry

• Cryo-EM

• Chromatographic methods

• Other orthogonal approaches

不同方法測量原理不同，結果也不一定完全相同。

Genome integrity

可以利用：

• Restriction analysis

• Southern blot

• Next-generation sequencing

• Long-read sequencing

• Other molecular assays

確認裝入 capsid 的 DNA 是否為預期的 full-length genome。

Purity and impurities

包括：

• Host-cell protein

• Host-cell DNA

• Residual plasmid DNA

• Residual nuclease

• Residual process reagents

• Aggregates

• Replication-competent AAV risk

• Microbial and endotoxin testing

Potency assay

Potency assay 必須盡可能反映產品的 mechanism of action。

依產品不同，可能需要測量：

• Cell entry

• Transgene expression

• Protein activity

• Downstream biological response

• Functional rescue

一個只測量 transgene mRNA 或 protein quantity 的 assay，不一定足以描述完整 potency。

因此，建立能夠與 clinical mechanism 連結、又具備足夠 precision 與 robustness 的 potency assay，經常是 AAV CMC 最困難的工作之一。

AAV 的臨床應用

Luxturna：局部眼科基因治療的重要里程碑

Luxturna 是一項用於 confirmed biallelic RPE65 mutation-associated retinal dystrophy 的 AAV vector-based gene therapy。

患者還必須保有足夠的 viable retinal cells，因為 gene delivery 需要有仍然存活、可以接受 vector 並表現 RPE65 的目標細胞。 (U.S. Food and Drug Administration)

Luxturna 的重要性不只是它成為核准產品，也證明在適合的疾病、局部給藥與清楚的 genetic diagnosis 下，AAV 可以轉化為具有臨床意義的治療。

眼睛是一個相對局部、可直接投遞且使用劑量較低的器官環境，這和需要透過全身高劑量治療大量肌肉的 DMD，非常不同。

Zolgensma：利用全身投遞治療 SMA

Zolgensma 使用 AAV-based vector 提供 functional SMN1 transgene，用於特定兩歲以下 SMA 兒童。 (U.S. Food and Drug Administration)

這項療法顯示 AAV 有機會透過一次性治療，改變嚴重遺傳疾病的自然病程。

但它也說明治療時機的重要性。

Gene Therapy 可以補充缺少的基因功能，卻不一定能完全逆轉已經失去的神經元。因此，新生兒篩檢、早期診斷與早期治療，可能直接影響最終治療結果。

Hemgenix 與 Roctavian：讓肝臟成為凝血因子工廠

Hemgenix 用於特定成人 Hemophilia B 患者，目標是讓肝細胞表現 Factor IX。 (U.S. Food and Drug Administration)

Roctavian 則是用於特定成人 severe Hemophilia A 患者的 AAV-based gene therapy，讓肝細胞表現 Factor VIII。 (U.S. Food and Drug Administration)

血友病是 liver-directed AAV gene therapy 很合理的應用，因為：

• 目標蛋白可由肝細胞產生並分泌至血液。

• 不必轉導身體每一個細胞。

• 即使恢復的凝血因子活性沒有達到正常人水平，也可能顯著降低出血風險。

但血友病 Gene Therapy 也顯示 durability 的複雜性。

部分患者的 transgene expression 可能隨時間下降，而不同患者間的表現量、免疫反應與持續時間也可能存在明顯差異。

「一次治療」不一定等於「所有患者終身維持相同療效」。

Upstaza：直接將 AAV2 投遞至腦部特定區域

Upstaza 是針對 aromatic L-amino acid decarboxylase deficiency 的 gene therapy。

它使用 non-replicating recombinant AAV2 vector，攜帶 human DDC gene，並透過 intraputaminal administration 將治療送到腦部特定位置。 (European Medicines Agency (EMA))

這個案例凸顯 route of administration 的價值。

當 systemic delivery 無法有效到達目標區域，或會造成過多非目標暴露時，局部、影像導引的精準投遞可能成為更合理的策略。

Elevidys：DMD Gene Therapy 的突破與爭議

Elevidys 是使用 AAVrh74 capsid 遞送 micro-dystrophin expression cassette 的 DMD Gene Therapy。

截至目前 FDA 的產品頁面，Elevidys 的適應症已限於四歲以上、仍可行走且具有 confirmed DMD gene mutation 的患者。 (U.S. Food and Drug Administration)

這項療法的重要性很高。

DMD 影響全身大量 skeletal muscle，而且患者需要的 vector dose 遠高於局部眼科 gene therapy。

這同時也讓 Elevidys 成為理解 systemic high-dose AAV risk 的重要案例。

Elevidys 安全事件：真正需要看懂的是什麼？

Elevidys 在 2023 年首次獲得 FDA accelerated approval，後續適應症曾擴大。

但 2025 年，安全事件改變了產品的風險評估。

2025 年 6 月，FDA 公布兩名接受 Elevidys 的 non-ambulatory pediatric male DMD patients，在治療後發生 fatal acute liver failure。 (U.S. Food and Drug Administration)

2025 年 7 月，FDA 表示截至 7 月 18 日，已收到三起使用 Sarepta AAVrh74 gene therapies 後發生 fatal acute liver failure 的通報；其中並非所有個案都屬於 Elevidys 的核准產品使用情境。 (U.S. Food and Drug Administration)

到了 2025 年 11 月，FDA 核准新的 boxed warning，並將 Elevidys 的適應症限制在仍可行走的 DMD 患者。 (U.S. Food and Drug Administration)

因此，原先將事件簡化為「第三名八歲兒童後來判定與 Elevidys 無關，所以恢復供藥」並不完整，也已經不符合後續監管發展。

目前比較準確的結論是：

• Elevidys 的適應症已經縮限。

• Acute serious liver injury 與 acute liver failure 成為 boxed warning 的核心風險。

• Non-ambulatory population 的風險效益評估已發生實質改變。

• AAV systemic therapy 的監測與患者選擇必須更加嚴格。

Elevidys 事件是否代表 AAV 平台失敗？

我認為不能這樣簡化。

Elevidys 事件反映的不是「所有 AAV 都一樣危險」，而是幾個風險因素疊加後的結果：

• 全身性 intravenous administration

• 非常高的 vector dose

• 大量 skeletal muscle target

• 肝臟仍可能承受顯著 vector exposure

• 患者本身的疾病狀態

• Capsid-specific 與 transgene-related immune responses

• 年齡、行走狀態與既有器官功能差異

• Corticosteroid 或其他 immunomodulation 是否足夠

局部、低劑量的眼科 AAV，和高劑量 systemic muscle-directed AAV，不能只因為兩者都叫 AAV，就視為相同的安全情境。

更精確的問題應該是：

對這個疾病、這個患者族群、這個 capsid、這個 expression cassette、這個劑量與這條給藥路徑而言，benefit-risk profile 是否可以接受？

AAV 的主要安全挑戰

Pre-existing neutralizing antibodies

很多人過去曾接觸自然存在的 AAV，因此體內可能已有 neutralizing antibodies。

即使抗體濃度不高，也可能結合 vector capsid、降低 tissue transduction，或加速 vector clearance。

因此，許多臨床試驗會在治療前篩檢 anti-AAV antibody。

但不同 assay、serotype 與 cutoff 之間並沒有完全一致的標準。

Repeat dosing

第一次接受 AAV 治療後，免疫系統通常會對 capsid 產生更強的抗體反應。

因此，再次使用相同或相近的 capsid，可能迅速被 neutralized。

這是 AAV 和部分 non-viral delivery systems 最大的差異之一。

Repeat dosing 的研究策略包括：

• 使用不同 capsid

• Plasmapheresis

• Antibody-degrading enzymes

• B-cell or plasma-cell modulation

• Transient immune suppression

• Capsid immune evasion

• Local delivery

• 更低劑量、更高效率的 vector

但每一種方法都會帶來新的 safety、manufacturing 或 regulatory 問題。

Hepatotoxicity

即使治療目標不是肝臟，systemically administered AAV 往往仍會有顯著部分到達 liver。

肝毒性可能涉及：

• Innate immune activation

• Adaptive immune response

• Capsid antigen presentation

• Transgene expression

• Dose-related cellular burden

• Complement and inflammatory pathways

• Patient-specific susceptibility

Hepatotoxicity 是 AAV Gene Therapy 中最常見且最受關注的不良反應之一，高劑量研究中也曾出現 severe hepatotoxicity 與 fatal liver failure。 (PubMed)

Complement activation、thrombocytopenia 與 thrombotic microangiopathy

高劑量 systemic AAV 可能引發 complement activation，並伴隨：

• Thrombocytopenia

• Hemolysis

• Renal injury

• Endothelial injury

• Thrombotic microangiopathy-like syndrome

這些反應可能發展快速，因此治療後早期 monitoring 非常重要。

Cellular immune response

Capsid peptides 或 transgene-derived peptides 可能經 MHC presentation 被 T cells 辨認。

這可能導致：

• Transduced cells 被清除

• Transgene expression 下降

• Tissue inflammation

• Loss of efficacy

• Organ-specific toxicity

Corticosteroid 經常被用來管理免疫反應，但並不是所有反應都能單靠 steroid 完全控制，尤其是在非常高的 systemic vector dose 下。 (Frontiers)

Dorsal root ganglion toxicity

在部分 intrathecal、intra-CSF 或高劑量 AAV 動物研究中，曾觀察到 dorsal root ganglion sensory neurons 的病理變化。

目前相關機制可能涉及：

• Excessive transgene expression

• RNA toxicity

• Cellular stress

• Immune-mediated injury

• Capsid、cargo、dose 與 delivery route 的交互作用

DRG findings 在 nonhuman primate studies 中較常見，臨床上的表現與人類風險仍需依個別產品評估。相關研究也顯示，免疫反應可能在部分 DRG pathology 中扮演因果角色。 (ScienceDirect)

AAV 治療後要監測什麼？

不同產品的 protocol 不同，但可能包括：

• ALT、AST、bilirubin

• Albumin

• Prothrombin time 或 INR

• Platelet count

• Creatinine 與 renal function

• Complement markers

• Troponin，視產品與風險而定

• Creatine kinase

• Cytokines

• Anti-capsid antibodies

• T-cell responses

• Transgene protein level

• Vector shedding

• Clinical functional outcomes

Long-term follow-up 也非常重要，因為一次性 Gene Therapy 的效果與潛在風險可能持續多年。

例如 Upstaza 的風險管理計畫，就包含至少十年的治療後 registry follow-up。 (European Medicines Agency (EMA))

Next-generation AAV：研究人員正在解決什麼問題？

Capsid engineering

過去常以天然 serotypes 為起點。

現在愈來愈多團隊利用：

• Directed evolution

• Rational design

• DNA shuffling

• Peptide insertion libraries

• Barcoded screening

• In vivo selection

• Human tissue models

• Machine learning

• Generative protein design

尋找具有更好特性的 capsids。

理想的新 capsid 不只需要提高 transduction，還希望同時改善：

• Tissue specificity

• Human translation

• Immune evasion

• Manufacturing yield

• Genome packaging

• Stability

• Lower liver exposure

• Lower effective dose

真正困難的是，這些性質不一定同時改善。

提高某個 organ tropism，可能降低 production yield；改變 antibody epitope，可能影響 receptor binding；增加 potency，也可能增加 off-target expression。

因此，下一代 capsid engineering 是 multi-objective optimization，而不是只尋找單一最高訊號。

以更低劑量達到相同療效

從 Elevidys 與其他 systemic AAV programs 可以看出，未來最有價值的進步之一，不是讓 vector 可以使用更高劑量，而是讓相同療效所需的劑量下降。

降低 dose 可能同時改善：

• Manufacturing burden

• Treatment cost

• Capsid antigen exposure

• Liver exposure

• Complement activation

• Repeat dosing feasibility

• Overall therapeutic window

因此，capsid、promoter、transgene、route of administration 與 patient selection 都必須一起最佳化。

更精準的 expression control

未來的 vector design 不只是把 promoter 換成 tissue-specific promoter。

還可能加入：

• Cell-selective enhancers

• microRNA target sites

• Inducible expression systems

• Detargeting elements

• Post-transcriptional regulation

• Protein degradation control

• Transgene activity switches

例如，在不希望表現 transgene 的細胞中加入特定 microRNA target sequences，有機會降低 off-target expression。

這類設計將使 Gene Therapy 從「送到器官」逐步進入「只在正確細胞、以正確劑量表現」。

Immune evasion 與 redosing

下一代 AAV 若要擴展到更普遍的疾病，repeat dosing 將成為重要問題。

免疫逃脫的方向可能包括：

• Capsid epitope engineering

• Antibody-resistant capsids

• Transient immune modulation

• Enzymatic antibody depletion

• Alternative route of administration

• Shielding strategies

• Sequential use of orthogonal capsids

但免疫系統不是只有 neutralizing antibody。

即使避開 antibody，也仍需考慮：

• Innate sensing

• Complement

• T-cell response

• Transgene immunity

• Patient infection history

• Immunosuppressive treatment risk

因此，「immune-evasive capsid」不是單一突變就能完全解決的問題。

AAV、LNP、Lentivirus 與 VLP：誰會成為下一代 Gene Therapy 平台？

我不認為這些平台之間只有競爭關係。

它們更像是不同用途的工具。

Platform	較適合的應用	主要優勢	主要挑戰
AAV	In vivo、長期蛋白表現	臨床經驗成熟，可在多種組織長期表現	Payload 小、免疫反應、redosing 困難
Lentivirus	Ex vivo cell therapy、HSC engineering	Stable integration、較大載量	Insertional risk、製程與細胞操作複雜
LNP	mRNA、siRNA、gene editing cargo	製程模組化、可遞送多種 RNA、具重複給藥潛力	Extrahepatic targeting 與細胞專一性仍需提升
VLP	Transient delivery of gene-editing proteins or RNPs	可短暫遞送編輯工具，降低長期表現	臨床與製造平台仍相對早期
Adenovirus	Vaccine、oncolytic applications	Payload 較大、表現強	免疫原性較高
HSV-based vector	CNS、oncolytic therapy、large cargo	Payload capacity 大、具神經相關應用潛力	Vector biology 與製造更複雜

AAV 適合需要長期表現、而且 therapeutic gene 可以放入有限 payload 的疾病。

LNP 則更適合需要短暫表現、可重複給藥，或遞送 mRNA 與 editing machinery 的應用。

Lentivirus 在 ex vivo cell therapy 中仍具有難以取代的價值。

真正重要的問題不是：

哪一個平台最好？

而是：

對這個疾病、目標細胞、治療機制與患者族群而言，哪一個 delivery strategy 最合理？

為什麼 AAV Gene Therapy 一次可能要價數百萬美元？

AAV Gene Therapy 的高價格，不能只用「公司想賺錢」或「製造很貴」單一解釋。

成本與定價通常同時受到多項因素影響：

• 患者人數非常少

• 早期研究失敗率高

• 長時間的 preclinical 與 clinical development

• GMP plasmid 與 viral vector manufacturing

• 低 yield 與高純化損失

• 複雜的 analytical testing

• Long-term follow-up

• Cold-chain logistics

• 專業治療中心與住院監測

• 一次性治療的支付模式

• 開發未成功 programs 的沉沒成本

但高開發成本不代表任何價格都自然合理。

當一次性治療價格達到數百萬美元時，保險公司、政府與醫療系統必須重新思考：

• 要一次支付，還是分期支付？

• 如果療效沒有維持，是否應有 outcomes-based payment？

• 哪些患者最有可能受益？

• 長期療效證據應該追蹤多久？

• 小型國家或單一保險制度如何承擔財務風險？

• 跨國患者能否取得治療？

• 製造成本下降後，價格是否會反映改變？

Gene Therapy 若要從少數罕見疾病走向更普遍的醫療應用，支付與可近性問題的重要性，不會低於 capsid engineering。

LuTra Studio Insight：AAV 已經證明基因治療可行，也開始碰到第一代平台的極限

回顧 AAV Gene Therapy 過去十多年的發展，我認為它已經完成了一個非常重要的任務：

證明把治療基因直接送進人體，可以真正改變遺傳疾病的自然病程。

Luxturna、Zolgensma、Hemgenix、Roctavian、Upstaza 與 Elevidys，分別讓我們看到眼睛、神經系統、肝臟與肌肉等不同器官的 Gene Therapy 可能性。

但這些產品也讓第一代 AAV platform 的限制變得更加清楚。

當治療從局部、低劑量的眼科疾病，走向需要全身、大範圍 transduction 的神經肌肉疾病時，capsid burden、肝臟暴露、免疫反應與 manufacturing demand 都會快速增加。

因此，我認為下一階段 AAV 的競爭，不會只是：

誰找到更多可以治療的基因？

而會逐漸轉向：

誰能以更低的劑量，把 cargo 更精準地送進正確細胞，同時減少非目標器官暴露與免疫反應？

這也是為什麼 engineered capsid、AI-assisted protein design、cell-specific promoter、immune modulation 與 next-generation manufacturing，會成為未來十年的核心。

我也不認為 AAV 會被 LNP 完全取代。

AAV 擅長長期 DNA expression；LNP 擅長較短暫的 RNA delivery；Lentivirus 適合 ex vivo stable cell engineering；VLP 則可能在 transient gene editing delivery 中找到位置。

未來不會是一個平台統治所有疾病。

而是不同 delivery technologies 根據疾病機制、目標器官、治療時間與安全需求，形成更精準的分工。

結語：Gene Therapy 的下一個突破，仍然取決於 Delivery

基因體學的發展，已經幫助我們辨認大量疾病相關基因。

但知道哪一個基因出了問題，並不等於我們已經知道怎麼治療。

真正困難的工作仍然是：

• 把治療送到正確器官

• 進入正確細胞

• 產生正確劑量的蛋白質

• 維持足夠長的療效

• 避免不可接受的免疫與毒性風險

• 建立可放大、可控制、可負擔的製程

AAV 已經讓 Gene Therapy 從概念走進臨床。

但 Elevidys 與其他高劑量 systemic programs 也提醒我們，AAV 並不是一個沒有上限的 delivery system。

科學進步的真正價值，不是只強調成功，也不是因為出現安全事件就否定整個平台。

更重要的是，從每一次成功與失敗中，重新理解 vector、cargo、patient biology、manufacturing 與 immune system 之間的關係。

只有當基礎科學、工程設計、臨床開發、CMC 與監管同步前進，Gene Therapy 才有機會從少數患者的突破性治療，逐步成為更成熟、更安全，也更容易取得的醫療選擇。

參考文獻

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