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精通 mRNA 合成（mRNA synthesis）：從體外轉錄、5′ 端加帽到 Poly(A) 尾端工程的完整解析


Diagram of mRNA synthesis: DNA template to IVT, poly(A) tail engineering, and 5’ capping. Shows coding region and purified mRNA.


前言



信使核醣核酸（messenger RNA, mRNA）已徹底改變現代醫療的可能性。作為一種治療平台，mRNA 使疫苗能夠快速開發，也推動了個人化癌症免疫治療與罕見疾病的蛋白質替代策略。然而，每一項成功的 mRNA 治療產品背後，都仰賴一套高度工程化的 mRNA 合成流程。


在多數討論中，mRNA 治療（mRNA therapeutics）的臨床成果往往成為焦點，但實際上，mRNA 合成（mRNA synthesis）的品質，才是真正決定轉譯效率、免疫反應、製程可擴展性與法規可行性的關鍵。體外轉錄（IVT）、5′ 端加帽（5′ capping）與 Poly(A) 尾端工程中的每一個決策，都會直接影響一個 mRNA 產品能否從實驗室順利推進至臨床與量產。


本文將以工程與 CMC（Chemistry, Manufacturing, and Controls）的視角，深入解析 mRNA 合成 的三大核心模組：


  • 體外轉錄（In Vitro Transcription, IVT）

  • 5′ 端加帽策略

  • Poly(A) 尾端工程



這三者共同構成現代治療級 mRNA 製造的技術骨幹。




第一部分：體外轉錄（IVT）——mRNA 合成的核心




什麼是體外轉錄（IVT）？



體外轉錄（IVT）是一種無細胞的酵素反應流程，利用噬菌體 RNA 聚合酶（最常見為 T7，也包括 SP6 與 T3），以 DNA 模板為起點合成 RNA。其中，T7 RNA 聚合酶因其高專一性、高轉錄速率與良好的放大製程相容性，仍是 mRNA 合成的黃金標準。


早期的 IVT 系統多使用純度有限的酵素，對轉錄完整性與雜質控制缺乏掌握；而現代 mRNA 合成平台，則已導入高純度酵素、化學定義緩衝系統與精密反應工程，以符合治療級與臨床製程需求。


從 CMC 的角度來看，IVT 同時也是 mRNA 製程中最主要的雜質來源之一，因此反應條件設計與下游純化策略，往往決定整體產品品質上限。



IVT 型 mRNA 合成的關鍵組成



  • DNA 模板：線性化 DNA，包含 T7 promoter、UTRs、ORF 與 poly(A) 序列

  • RNA 聚合酶：T7 或其工程化變異株

  • 核苷酸三磷酸（NTPs）：原生或修飾核苷酸（如 pseudouridine）

  • 反應緩衝系統：Mg²⁺、DTT、spermidine 等

  • 加帽試劑（若採用共轉錄加帽）




IVT 技術的近期創新



近年 mRNA 合成領域的技術進展，針對多項長期瓶頸提出解法：


  • 雙股 RNA（dsRNA）雜質：透過核苷酸餵料控制與緩衝優化，大幅降低免疫刺激性雜質

  • 中止轉錄（abortive transcripts）：工程化 T7 變異株提升 processivity

  • 自動化與放大製程：提升重現性與製造穩定性




工程化 T7 RNA 聚合酶



  • T7 RNAP Y639F：提升修飾核苷酸（如 Ψ）的導入效率

  • 高 processivity 變異株：降低中止轉錄

  • 融合酵素系統（如 FCE::T7RNAP）：整合轉錄與加帽為單一步驟




IVT 最佳實務建議



  • 維持 NTP 比例平衡，避免 GTP 過量造成 dsRNA

  • DNA 模板製備使用高保真聚合酶

  • 轉錄後進行 DNase 處理與 HPLC 等純化





第二部分：5′ 端加帽——確保轉譯效率與穩定性




為什麼 5′ 加帽在 mRNA 合成中如此關鍵？



5′ 端加帽結構模擬真核 mRNA，對於：


  • 防止核酸酶降解

  • 核糖體辨識

  • 轉譯起始



皆不可或缺。加帽不完全或異質性高，是 mRNA 轉譯效率失敗與免疫活化最常被忽略的原因之一。



Cap 結構演進



  • Cap-0：m⁷GpppN

  • Cap-1：m⁷GpppNm

  • Cap-2：第二核苷額外甲基化



👉 對治療級 mRNA 而言，Cap-1 通常是首選，具較佳免疫相容性。



mRNA 合成中的加帽策略



  • 轉錄後酵素加帽：高純度，成本高

  • 共轉錄加帽：ARCA、CleanCap

  • 混合策略：平衡效率與規模化




新興加帽技術



  • FCE::T7RNAP 融合系統

  • PureCap（RP-HPLC 純化）

  • On-column capping




加帽實務建議



  • 臨床應用優先選擇 Cap-1

  • 使用電泳或質譜驗證加帽效率

  • 早期即與 CMC 策略整合





第三部分：Poly(A) 尾端工程——穩定性與轉譯最佳化




Poly(A) 尾端在 mRNA 合成中的角色



Poly(A) 尾端透過與 PABP 結合，影響 mRNA 穩定性、轉譯效率與降解動態。


⚠️ Poly(A) 長度並非越長越好，而是一個非線性最佳化問題。



Poly(A) 加成方式



  • 模板編碼型：固定長度（常見 100–120 nt）

  • 酵素加尾型：IVT 後加入，長度變異




最新分析技術



  • LC–MS 高解析分析

  • SEC–UV 快速 QC

  • 合成生物流程 控制尾長




設計建議



  • 疫苗建議長度：100–120 nt

  • <60 nt 轉譯效率下降

  • 過長可能影響穩定性

  • 使用 HPLC 或 beads 移除不完整物種





結語：為真實世界打造可落地的 mRNA 合成技術



mRNA 合成（mRNA synthesis）早已不再只是學術問題，而是決定產品能否成功轉譯、核准與量產的關鍵工程能力。


體外轉錄、5′ 加帽與 Poly(A) 尾端工程，構成了現代治療級 mRNA 製造的技術核心。隨著 mRNA 應用拓展至腫瘤、代謝疾病與再生醫學，對合成流程的深度掌握，將成為平台競爭力的分水嶺。




mRNA 合成與 CMC 技術顧問服務



（mRNA Synthesis & CMC Technical Consulting）


當 mRNA 治療專案從概念邁向臨床開發，許多瓶頸並非來自 RNA 生物學本身，而是來自 mRNA 合成設計、製程穩定性與 CMC 準備度。


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服務範圍包括：


  • mRNA 合成策略評估（IVT、5′ 加帽、Poly(A) 設計）

  • dsRNA 雜質風險分析與改善策略

  • 治療級 mRNA 的早期 CMC 規劃

  • 製程穩定性、放大與一致性討論

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References



He W. et al. Effective Synthesis of High-Integrity mRNA Using In Vitro Transcription. Molecules, 2024.

Frontiers in Molecular Biosciences (2023). Controlled Nucleotide Feeding Reduces dsRNA Impurities.

FCE::T7RNAP Fusion System. bioRxiv, 2023.

PureCap Method. Nature Communications, 2023.

On-column Capping. ResearchGate, 2023.

SEC–UV Analysis. Waters Application Note, 2023.

LC–MS Poly(A) Characterization. Thermo Fisher Scientific, 2023.

Tail-Length Defined Protocols. Synthetic Biology Protocols, 2024.

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